|
|
Konstrukce a charakterizace rekombinantních systémů pro analýzu stresové odpovědi u rhodokoků degradujících polutanty
Křenková, Lucie ; Štěpánek, Václav (vedoucí práce) ; Marešová, Helena (oponent)
Rhodococcus je rod grampozitivních nesporulujících aktinobakterií ze skupiny Mycolata, který vyniká svou odolností vůči mnohým fyzikálním a chemickým stresorům a obrovským metabolickým potenciálem, což umožňuje jeho zástupcům účinně degradovat širokou škálu toxických sloučenin. Pro efektivní využití těchto schopností je nezbytné znát molekulární podstatu odpovědi rhodokoků na působení stresů, jejíž regulaci řídí především faktory σ RNA polymerázy. Funkce těchto stresových faktorů σ jsou však u rhodokoků jen málo popsány. Tato práce se zabývá možnostmi využití Rhodococcus erythropolis CCM2595 jako modelového organismu pro studium stresových odpovědí u rhodokoků. Byl vytvořen sigH mutant R. erythropolis, zkonstruovány jednoplazmidové kmeny pro studium aktivit promotorů stresových genů přímo v R. erythropolis a testována jejich odpověď na osmotický, teplotní a oxidativní stres měřením intenzity fluorescence produkovaného GFP. Dále byly připraveny funkční homologní dvouplazmidové kmeny využívající indukovanou nadexpresi faktorů . Srovnání s heterologními systémy založenými na hostiteli Corynebacterium glutamicum však ukázalo, že využití samotných rhodokoků jako hostitelů pro dvouplazmidové systémy je zatím omezené, patrně kvůli nestabilitě plazmidů v buňkách rhodokoků. Pro rutinní přiřazování...
|
|
|
Doména 1.1 primárního faktoru sigma a nový systém pro expresi RNA polymerázy z Bacillus subtilis.
Kálalová, Debora ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Cvačková, Zuzana (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) je klíčový vícepodjednotkový enzym genové exprese, který spolu s faktorem σ tvoří holoenzym a zajišťuje přepis genetické informace z DNA do RNA. V této práci byla studována RNAP z Bacillus subtilis a její primární faktor σA . Faktor σA určuje specifitu pro promotory, na které holoenzym nasedá. Součástí jeho struktury je doména 1.1, která pravděpodobně vazbou na domény 2 a 4 zabraňuje vazbě samotné σA na promotor, pokud není součástí holoenzymu. První část práce ověřuje hypotézu, zda doména 1.1 váže domény 2 a 4 a brání tak vazbě samotné σA na promotor. Za tímto účelem byly vytvořeny různé doménové konstrukty, u kterých byly testovány vzájemné interakce. Interakce domén byla testována metodami Nitrocellulose filter binding assay, EMSA a transkripcí in vitro. Výsledky neprokázaly významnou interakci mezi doménami. Druhá část práce se věnuje vytvoření nástroje pro studium enzymologie RNAP z B. subtilis - rekombinantní RNAP (rRNAP). Nejprve byl řadou klonovacích kroků vytvořen plazmidový konstrukt pro expresi rRNAP v Escherichia coli, následně byl protein izolován a charakterizován. Izolace se podařila bez kontaminace faktory σ (tato kontaminace je častá při izolaci RNAP z B. subtilis). Byla však zjištěna přítomnost ATP (nikoli GTP) a vazba této molekuly by mohla mít biologickou...
|
host ::
RSS.